深度学习 | 搭建自动化类器官灌流培养与高通量药物筛选平台
发布日期：2024-04-11 10:44:25浏览次数：269
北京时间2023年11月初，由ALIT Biotech(艾力特生物科技)与美国Genetic Engineering & Biotechnology News联合主办了主题为“使用患者来源的类器官进行高通量药物筛选的最佳策略”GEN网络研讨会。其中，来自ALIT Biotech的陈凯博士重点介绍了在类器官培养建模、高通量成像分析方面的解决方案，为大家展示了一个高通量、高效和基于AI智能的全新流程。接下来，小编将带大家重点回顾主要内容。
1、类器官高通量药物筛选流程
一个常见的类器官高通量药物筛选流程，主要可分为三部分：样本准备、类器官建模与培养、高通量药物筛选。目前，通常采用平底孔板进行类器官培养扩增，并通过96或384孔板进行高通量加药筛选。由于类器官培养周期较长，会涉及到多次人工换液过程。此外，目前越来越多的研究者采用芯片方式进行体外模型构建与药物筛选测试，其基本流程比上述传统方法更简化，将细胞或类器官接种到芯片后进行灌流培养，之后直接在芯片内加入药物进行测试，最后采用终点法进行显微镜成像和数据分析。然而，在运用类器官进行高通量筛选方面，上述两个流程均存在许多挑战。
2、传统类器官培养的挑战
采用传统孔板培养类器官的方式，由于胶滴的内部营养物质交换比较差，会导致较低的细胞活率和产率，且类器官培养的一致性较差。大量的人工换液操作和复杂培养步骤难以标准化和控制。采用器官芯片进行体外建模时，生物和物理环境控制是一大挑战，其中涉及大量手工操作和个性化搭建过程，通量较低，过程难以监控和重复。在高通量筛选检测方面，成像分析是其中的核心关键方法。类器官在培养的胶滴内呈现随机三维分布的特征，传统的显微镜需要手动调焦去实现不同Z轴平面的观察和拍照，该过程非常的耗时，且得到的固定焦距图像中，有许多类器官出现虚焦、不清晰的现象。单个视野也无法覆盖整个胶滴，导致很多类器官不会被拍摄到。此外，由于目前大部分图像分析工具基于2D细胞开发，并不能很好的适用于3D类器官分析需求，且固定的分析模式也限制和无法满足很多新的应用场景需求。因此，我们需要开发优化类器官构建流程，更好地应用于疾病药物筛选。
3、类器官高通量模型构建与药物筛选新方案
针对当前存在的困难与挑战，ALIT Biotech提供的全流程解决方案，包括类器官高通量模型构建与高通量药物筛选。首先，细胞可直接接种到类器官灌流培养芯片内，之后放入Hvita系统进行自动灌流培养和快速扩增，相比采用传统孔板的非灌流方式，可节省至少67%人工时间，增加1.5-13倍的细胞活力，扩增得到的大量类器官可进行下游高通量药物筛选和检测。同时，开放式灌流仿真平台Hvita系统可兼容多种器官芯片，实现全自动、一致的体外模型构建和药物剂量分配。结合先进成像系统和最新AI图像分析算法，Castor S2能够实现单个96孔板、4分钟内检测完毕的检测分析需求，并且，已有9个标准类器官模型可以保证识别准确率达到80%以上。
Hvita 3D活细胞自动灌流培养系统，包含控制主机和培养舱两个部分。按照功能可以划分为四大模块，控温、控气模块可让系统环境非常稳定，保证类器官长时间灌流培养所需要的温度、CO2浓度的精确控制。泵液模块可以实现1μL/min~7mL/min范围内的泵液速度调节，每个培养舱内配置了6个独立的泵液单元，能同时进行多种不同工艺条件下的细胞灌流培养，极大拓展您的工艺开发空间。另外，软件系统满足合规化的管理要求，所有的实验信息和操作信息都会被记录并可追溯。此外，控制主机最多可控制4个培养舱，即可同时实现最多24个灌流样本和工艺条件的测试。Hvita 系统本质上是一个开放的活细胞灌流培养平台，除了我们自主开发的类器官灌流培养芯片之外，它还可以兼容各种商业化的微流控芯片和器官芯片，让用户可以做自己感兴趣的研究和拓展。
Hvita系统单个培养舱可实现6个类器官灌流培养芯片培养，最多可实现24个样本平行测试，满足高通量的类器官培养、扩增和建库需求。触摸屏的软件操作，合规软件设计可实现培养过程的全自动监测控制，并记录灌流流速等参数的动态曲线变化。因此，Hvita系统非常适合进行多参数平行测试和工艺条件开发。我们通过对小肠类器官不同培养流速的测试对比发现，15μL/min 的灌流速度可得到最高细胞活力的结果。
我们自主设计的类器官灌流培养芯片，有两个纵向的半透膜，可将细胞培养区与培养液供给区分隔开来，实现培养液动态更新的同时，不会损伤到脆弱的类器官样本，膜的纵向设计确保了产品可进行实时显微成像观测，又不影响养分和代谢产物的交换。同时灌流给予的液体剪切力可以更真实模拟体内生理环境。结合Hvita系统，可实现类器官长时间连续的自动灌流培养，无需人工换液，相比传统孔板培养方式可节省67%以上人工时间，同时极大提高类器官培养的活率。通过接种不同的细胞密度进行连续培养后对比，ATP检测结果表明可增加1.5-13倍的细胞活力。此外，分析培养得到的类器官面积分布发现，类器官灌流培养芯片结合Hvita系统可让培养的类器官尺寸分布更加均一，极大提高类器官的一致性，保证下游实验的可重复性。
Hvita系统单个培养舱可实现6个类器官灌流培养芯片培养，最多可实现24个样本平行测试，满足高通量的类器官培养、扩增和建库需求。触摸屏的软件操作，合规软件设计可实现培养过程的全自动监测控制，并记录灌流流速等参数的动态曲线变化。因此，Hvita系统非常适合进行多参数平行测试和工艺条件开发。我们通过对小肠类器官不同培养流速的测试对比发现，15μL/min 的灌流速度可得到最高细胞活力的结果。
我们自主设计的类器官灌流培养芯片，有两个纵向的半透膜，可将细胞培养区与培养液供给区分隔开来，实现培养液动态更新的同时，不会损伤到脆弱的类器官样本，膜的纵向设计确保了产品可进行实时显微成像观测，又不影响养分和代谢产物的交换。同时灌流给予的液体剪切力可以更真实模拟体内生理环境。结合Hvita系统，可实现类器官长时间连续的自动灌流培养，无需人工换液，相比传统孔板培养方式可节省67%以上人工时间，同时极大提高类器官培养的活率。通过接种不同的细胞密度进行连续培养后对比，ATP检测结果表明可增加1.5-13倍的细胞活力。此外，分析培养得到的类器官面积分布发现，类器官灌流培养芯片结合Hvita系统可让培养的类器官尺寸分布更加均一，极大提高类器官的一致性，保证下游实验的可重复性。
可将自主设计的芯片或商业化灌流芯片接入Hvita系统，进行体外模型构建与加药筛选测试，再利用Castor S2 进行高通量成像分析。
整个体外芯片模型的灌流控制、加药处理均可实现自动化和记录监测;高达24个芯片的同时运行，帮您实现高通量测试需求;各项参数的记录和条件的可控性保证了可重复的培养过程和可重复的结果;可以实现整个芯片腔室的高清成像、层扫叠加和拼接展示。这也是客户利用商业化芯片进行药物测试后，采用Castor S2进行荧光活率分析的结果。
针对目前缺乏高通量和准确的图像分析工具和方法的问题，ALIT新开发了一款专门针对类器官高通量成像分析的系统：Castor S2高通量智能3D细胞分析仪。它具备4x和10x两个高NA值物镜，制冷的彩色相机，红绿蓝3色荧光通道;可实现快速自动Z轴层扫、2D投影和大图拼接。此外，Castor S2 采用人工智能(AI)图像识别和分析算法，可为类器官形态和表型的定量表征提供快速和准确的分析结果。同时，基于AI训练迭代的方式可以允许拓展定制化的分析和新实验流程，以应对各种复杂样品高通量检测的挑战。
Castor S2进行高通量成像和数据分析的基本流程如下：首先，在每个位置进行Z轴层扫和2D投影，然后移动到下一个位置进行层扫，直至拍完全部的区域。然后，系统自动进行图片拼接得到整个胶滴的图像，并利用AI算法进行图像分析，最后，输出定量化、可视化图像并展示。选择标准的实验程序，所有上述成像和分析过程全部自动完成。传统方法中，每个96孔板手动成像至少需要30分钟，分析2小时以上。Castor S2能够在半个小时内完成96孔板明场成像和分析，其中明场成像仅需要4分钟，可节省超过80%的时间!
对于明场和荧光图像，AI算法模型能很好的进行准确分析，并能提供多个形态学量化数据，包括类器官个数、活率、面积、长短轴、平均直径、圆度和平均荧光强度等结果。目前，软件提供可兼容9种以上类器官的标准AI算法模型，包括：结胃癌类器官、直肠癌类器官、肝癌类器官等，识别准确度可达到80%以上，部分可达到95%。我们也在持续进行模型迭代和升级，未来将免费提供。此外，我们还可以为新的类器官类别或复杂实验需求进行定制化开发，基于AI模型标注和训练数据集进行多样化分析，包括单个类器官的分析和时间序列的追踪分析等，最后形成新的标准程序可供客户使用。
综上，Castor S2凭借高速、高通量成像、精准识别和可拓展的定制化程序，让通过类器官进行高通量筛选变得简单和唾手可得，极大助力和加速类器官领域前沿研究与产业化发展。
Castor S2 进行高通量、无标记类器官生长分析：对同一个 96 孔板的类器官进行连续监测和分析，并在软件中直观展示，同时得到量化的表型数据和生长分析曲线。每个 96 孔板明场成像和分析仅需 30 分钟即可完成，配上自动化工作站，每天最多可满足 48 个孔板的检测。
Castor S2 进行高通量药物筛选：加药处理后，利用 Castor S2 进行明场和荧光成像分析，可得到不同药物处理后的类器官图像，以及通过荧光染料 AOPI 染色后的类器官活率结果，该结果可直接作为后续药筛结果的判定和决策的依据。
Castor S2 进行类器官杀伤实验：目前，越来越多的研究者采用患者来源的类器官进行杀伤实验，用以进行肿瘤免疫学研究、靶向药物和细胞治疗药物的药效评价。运用Castor S2进行类器官杀伤实验，不仅可以得到直观的形态学变化图像，还能准确识别、得到量化的分析数据，包括类器官活率、免疫细胞活率和平均荧光强度等，让复杂的、传统方法无法实现的分析成为可能。
综上，针对当前运用类器官进行高通量筛选的困难与挑战，艾力特可以提供简化流程的解决方案，包括类器官高通量快速模型构建、高通量成像和数据分析：
● 使用Hvita 3D类器官培养系统实现高质量、高产量和可重复的类器官培养
● 与开放式灌流仿真平台和多种器官芯片的高度兼容性，可实现自动、一致的体外模型构建和药物剂量分配
● 使用Castor S2系统加速3D类器官成像，4分钟内完成 96 孔板明场层扫成像
● 通过AI人工智能图像分析算法准确识别和表征各种类器官，加速数据分析流程
让类器官技术在高通量药物筛选领域的运用更高效、让生命更健康!