你真的会用血球计数板吗

发布日期:2021-06-21 10:42:00浏览次数:553

血球计数板计数细胞浓度和活率是一个比较常规简单的方法,但是您真的会用吗?下面小编跟大家聊聊如何正确使用血球计数板。

血球计数板计数室一览

血球计数板用优质厚玻璃制成。每块计数板由H形凹槽分为2个同样的计数池。计数池两侧各有一支持柱,将特制的专用盖玻片覆盖其上,形成高0.10mm的计数池。计数池放大后如下图1所示


哪里是我们进行计数的区域

整个网格区域分为9个大方格,其中四角及中间大方格为我们的计数区域,我们根据大方格中小方格数分两种:如下图2黄色区域和下图2蓝色区域,两个区域计数体积相等,计数体积为1mm*1mm*0.1mm=1/104ml;其中黄色区域又平均分25个较小方格,通常为了减少工作量,只计数其中5个更小的方格,如下图2亮黄色区域;蓝色计数区域则平均分为16个较小的方格。

如何不同区域细胞进行计数


16小方格的蓝色和25小方格的黄色计数区,长宽都是1mm,盖玻片覆盖在计数池上方形成0.1mm深度的空间,我们可以得出两个区域可以充满的液体体积为:1mm×1mm×0.1mm=1/104ml,细胞浓度=#cell/ml=测量区域细胞个数/测量区域体积×稀释倍数=测量区域细胞个数×104×稀释倍数。下面我们分别总结下不同的方格计算公式:

16小方格计数区计算公式:
1、如果计数的是1个如上图2所示蓝色区域:#cell/ml=细胞个数×104×稀释倍数
2、如果计数的是4个蓝色区域:#cell/ml=4个大方格细胞个数/4×104×稀释倍数
3、如果只计数蓝色区域16格中的一个小方格:#cell/ml=细胞个数×104×16×稀释倍数

25小方格计数区计算公式:

1、如果计数的是1个如上图2所示整个黄色区域:#cell/ml=细胞个数×104×稀释倍数:

2、如果计数的是1个如上图2所示黄色区域中的一个小方格:#cell/ml=细胞个数×104×25×稀释倍数3、如果计数的是1个如上图2所示黄色区域中的四角及中间5个小方格:#cell/ml=细胞个数×104×5×稀释倍数


如何选择最合适的计数区进行计数


根据细胞密度判断,如果密度比较小,可以计数蓝色区域大方格,如果细胞密度适中,可以计数蓝色区域16个大方格中的一个,如果细胞密度较小,则计数黄色区域25方格中的较小方格,但是无论选择哪种方式计数,每个方格中至少有20-50个细胞来计数;细胞密度过高,往往会更容易造成操作者疲劳增加出错概率,故建议每个方格中最多计数100个左右细胞为宜。

根据细胞大小进行判断,通常10μm以上的细胞选择蓝色区域,10μm以下的细胞选择黄色区域计数;这主要跟计数区域面积及显微镜放大倍数有关,10μm以下的细胞需要切换高倍物镜才能看清细胞形态,而高倍物镜下面无法显示大方格完整区域,故选用25格计数区域中较小方格更好;
计数原则:如果有细胞落在方格边缘线上,那么可以记上不计下,计左不计右。
计数区域大小也是决定结果准确很重要的因素,建议尽量计数4个上图2所示蓝色区域进行计数,从而减少加样的分布误差及由于计数样本量过少带来的误差。




综上,计数需要注意事项如下:

1、保持计数板及盖玻片清洁干燥;

2、保持稳定的计数小室:先加盖专用的盖玻片(比普通盖玻片厚一些),形成稳定的计数室,一次性充满计数室,减少多余细胞液溢出导致的误差,这里一般加样10微升;

3、保证细胞完全沉降:加样后,一般需静置3-5min左右,使细胞完全沉降到计数板底部;
4、在最适范围内计数:以20μm直径大小细胞为例,血球计数板计数范围:1×104-5×107,但是由于血球计数板本身属于抽样计数法,抽样个数过少会造成计数不准,相反,如果细胞密度过大,会加重操作者的疲劳和负担,同样也会造成计数不准,建议加样浓度为2×105-1×106为宜。