你真的会用血球计数板吗

发布日期：2021-06-21 10:42:00浏览次数：3427

血球计数板计数细胞浓度和活率是一个比较常规简单的方法，但是您真的会用吗？下面小编跟大家聊聊如何正确使用血球计数板。

血球计数板计数室一览

血球计数板用优质厚玻璃制成。每块计数板由H形凹槽分为2个同样的计数池。计数池两侧各有一支持柱，将特制的专用盖玻片覆盖其上，形成高0.10mm的计数池。计数池放大后如下图1所示

哪里是我们进行计数的区域

整个网格区域分为9个大方格，其中四角及中间大方格为我们的计数区域，我们根据大方格中小方格数分两种：如下图2黄色区域和下图2蓝色区域，两个区域计数体积相等，计数体积为1mm*1mm*0.1mm=1/10⁴ml；其中黄色区域又平均分25个较小方格，通常为了减少工作量，只计数其中5个更小的方格，如下图2亮黄色区域；蓝色计数区域则平均分为16个较小的方格。

如何不同区域细胞进行计数

16小方格的蓝色和25小方格的黄色计数区，长宽都是1mm，盖玻片覆盖在计数池上方形成0.1mm深度的空间，我们可以得出两个区域可以充满的液体体积为：1mm×1mm×0.1mm=1/10⁴ml，细胞浓度=#cell/ml=测量区域细胞个数/测量区域体积×稀释倍数=测量区域细胞个数×10⁴×稀释倍数。下面我们分别总结下不同的方格计算公式：

16小方格计数区计算公式：

1、如果计数的是1个如上图2所示蓝色区域：#cell/ml=细胞个数×10⁴×稀释倍数

2、如果计数的是4个蓝色区域：#cell/ml=4个大方格细胞个数/4×10⁴×稀释倍数

3、如果只计数蓝色区域16格中的一个小方格：#cell/ml=细胞个数×10⁴×16×稀释倍数

25小方格计数区计算公式：

1、如果计数的是1个如上图2所示整个黄色区域：#cell/ml=细胞个数×10⁴×稀释倍数：

2、如果计数的是1个如上图2所示黄色区域中的一个小方格：#cell/ml=细胞个数×10⁴×25×稀释倍数3、如果计数的是1个如上图2所示黄色区域中的四角及中间5个小方格：#cell/ml=细胞个数×10⁴×5×稀释倍数

如何选择最合适的计数区进行计数

根据细胞密度判断，如果密度比较小，可以计数蓝色区域大方格，如果细胞密度适中，可以计数蓝色区域16个大方格中的一个，如果细胞密度较小，则计数黄色区域25方格中的较小方格，但是无论选择哪种方式计数，每个方格中至少有20-50个细胞来计数；细胞密度过高，往往会更容易造成操作者疲劳增加出错概率，故建议每个方格中最多计数100个左右细胞为宜。

根据细胞大小进行判断，通常10μm以上的细胞选择蓝色区域，10μm以下的细胞选择黄色区域计数；这主要跟计数区域面积及显微镜放大倍数有关，10μm以下的细胞需要切换高倍物镜才能看清细胞形态，而高倍物镜下面无法显示大方格完整区域，故选用25格计数区域中较小方格更好；

计数原则：如果有细胞落在方格边缘线上，那么可以记上不计下，计左不计右。

计数区域大小也是决定结果准确很重要的因素，建议尽量计数4个上图2所示蓝色区域进行计数，从而减少加样的分布误差及由于计数样本量过少带来的误差。

总结

综上，计数需要注意事项如下：

1、保持计数板及盖玻片清洁干燥；

2、保持稳定的计数小室：先加盖专用的盖玻片（比普通盖玻片厚一些），形成稳定的计数室，一次性充满计数室，减少多余细胞液溢出导致的误差，这里一般加样10微升；

3、保证细胞完全沉降：加样后，一般需静置3-5min左右，使细胞完全沉降到计数板底部；

4、在最适范围内计数：以20μm直径大小细胞为例，血球计数板计数范围：1×10⁴-5×10⁷，但是由于血球计数板本身属于抽样计数法，抽样个数过少会造成计数不准，相反，如果细胞密度过大，会加重操作者的疲劳和负担，同样也会造成计数不准，建议加样浓度为2×10⁵-1×10⁶为宜。