微载体培养的细胞计数 第二期

发布日期:2021-07-13 10:27:00浏览次数:615

在细胞培养工作中,常需要了解细胞生活状态和鉴别细胞死活,确定细胞接种浓度和数量以及了解细胞存活率和增殖度,如用酶消化制备的细胞悬液中细胞活力的鉴别,冻存细胞复苏后的活力检测等。

细胞悬液制备后,如果是细胞系常用活体染料台盼蓝对细胞进行染色,进行细胞计数。台盼蓝不能透过活细胞正常完整的细胞膜,故活细胞不着色。而死亡细胞的细胞膜通透性增高,可使染料进入细胞内而使细胞着色(蓝色)。如果是本身成分比较复杂的原代细胞常用AO/PI荧光方法进行染色,AO标记活细胞发绿色荧光,PI标记死细胞发红色荧光,通过双染的方法准确识别活细胞和死细胞浓度、活率等。
但是微载体固定床上培养的细胞需要用特定的裂解液使其裂解后才能脱离固定床制成裸核悬液,而细胞裂解后台盼蓝染色法和AO/PI荧光法均无法标记,这是因为裂解液会导致台盼蓝成絮状,AO/PI荧光猝灭。上一期我们有介绍微载体培养的细胞计数结果情况。本期我们从细胞裂解原理入手再次了解裸核细胞计数情况。
微载体固定床上培养的细胞主要是裂解液处理法来处理细胞,细胞裂解液的主要目的有以下几种:(1)利用去污剂破坏脂质双分子层,破裂细胞;(2)溶解蛋白;(3)蛋白变性使其稳定;(4)抑制蛋白酶活性。
主要根据不同的目的,裂解液的组成有所不同。以下是细胞裂解中常用试剂和其作用:50 mM Tris-HCl pH 7.4(缓冲体系),150 mM NaCl(等渗体系),1 mM PMSF (强大的蛋白酶抑制剂),1 mM EDTA(变性剂和稳定剂),5 µg/ml Aprotinin(蛋白酶抑制剂),5 µg/ml Leupeptin(蛋白酶抑制剂),1% Triton x-100(破坏细胞),1% Sodium deoxycholate(中度变性剂和蛋白溶解剂),0.1% SDS(强变性剂和蛋白溶解剂)。7M 尿素,2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解),蛋白酶K等。
本期主要对比裂解前后的细胞,采用Countstar细胞计数仪对其进行浓度及粒径稳定性测试,详细结果如下。微载体培养的细胞一般为常规的细胞,不存在较复杂的背景,裂解前采用台盼蓝方法即可,本次实验数据为某样机客户端293细胞裂解前后测试结果,细胞浓度均为稀释后上样测试浓度不是原始浓度。裂解前台盼蓝染色计数结果如下图1。三个复孔检测细胞平均粒径为16um,细胞浓度孔间差CV为3.94%,细胞直径孔间差为0.35%。


图1 裂解前细胞图片及粒径分布情况

用裂解液裂解后的裸核细胞,采用Countstar细胞计数模式检测结果如下图2,三个复孔检测细胞平均粒径为8um。细胞浓度孔间差CV为1.47%,细胞直径孔间差为3.08%。



图2 裂解后细胞裸核图片及粒径分布情况

裂解后的裸核细胞既不能适用台盼蓝方法,因为裂解液使AO/PI荧光猝灭的原因荧光方法也无法准确标记,Countstar通过参数设置检测细胞裂解前裂解后浓度、直径结果均很稳定,为该类细胞提供准确的计数方法,裂解后的裸核细胞粒径约为裂解前细胞的一半。